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陇科学股份有限公司)；甲酸、乙酸铵(HPLC 级，美国Fluka 公司)；无水硫酸钠(分析纯，西陇科学股份有限公司)；十八烷基硅烷(C18)(上海安谱实验科技股份有限公司)；Na2EDTA ·2H2O(分析纯，广东光华科技股份有限公司)；磷酸氢二钠、一水合柠檬酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验室用水为一级水(18.2 MΩ·cm)。
2 实验方法
2.1 溶液配制
标准储备液：对于固体标，分别称取相当于标准品10 mg (精确至0.01mg)置于10.0mL 容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，配制为浓度为1000mg/L 的标准储备液，-18℃避光保存。
标准工作溶液：准确吸取适量标准储备液，用乙腈逐级稀释配制成系列标准工作溶液，现用现配。
基质空白标准工作溶液：准确吸取适量标准储备液加入6份空白样品，同2.2.2处理配制成系列基质空白标准溶液，现用现配。
Na2EDTA-Mcilvaine 缓冲溶液(0.1 mol/L)：准确称取37.2 g Na ２EDTA ·2H2O 、10.9g 磷酸氢二钠和12.9
g 柠檬酸于烧杯内，加入一级水约900mL ，搅拌使其溶解，使用1mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至4.0，定容至1000mL 容量瓶，摇匀即可。
酸化乙腈(含1%甲酸的乙腈溶液，V/V)：准确吸取1mL 甲酸于100mL 容量瓶中，用乙腈定容，混合均匀。
2.2 样品前处理
称取5.0g(精确至0.1 g)样品于50mL 具塞塑料离心管中，加入100μL 50μg/L 内标溶液(MG-D5和LMG-D6)，加入2mL
0 引言
近年来，水产品的消费呈逐年递增趋势[1]，三苯甲烷类染料、氯霉素类、磺胺类、氟喹诺酮类和四环素类等是目前水产品养殖环节常用的病虫害防治药物。按照我国相关食品安全标准，三苯甲烷类染料、氯霉素类由于毒性较强目前已经禁止在水产品养殖等环节使用。按照《GB 31650—2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类为限制使用药物[2］
。本研究针对水产品中重点监控的兽药残留种类，采用液相谱－串联质谱检测技术结合分散固相萃取方法实现了5类41种渔用药物残留的同时前处理并检测，方法简单快速，为水产品药物残留的有效监控
提供了快捷的方法。
1 实验部分
1.1 材料与方法1.1.1 仪器与试剂
Agilent 6470三重串联四极杆液相谱/质谱联用仪(带有鞘气装置的电喷雾离子源)(美国Agilent 公司)；IKA-T18型均质器(德国IKA 公司)；BUCHI R-3型旋转蒸发器(瑞士BUCHI 公司)；MS 204S 分析天平(梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司)；JJ1000型常量天平(常熟双杰电子有限公司)；TGL-16M 型高速冷冻离心机(湖南湘仪)；ELGA-Micrae+Purelab 纯化水系统(英国ELGA 公司)。
41种药物的标准品及孔雀石绿盐-D5(MG-D5，纯度98.0%)无(隐性)孔雀石绿-D6标准品(LMG-D6，纯度96.4%)，购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司。
乙腈和正己烷(HPLC 级，德国Merk 公司)；甲醇(HPLC 级，西
液相谱-串联质谱法 同时检测水产品中41种兽药残留
梁任佳 李学劲 梁光纤 王华 蒙丽琼*
(中国检验认证集团广西有限公司，广西 北海 536000)
摘要：目的建立了同时测定水产品中磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、氯霉素类和三苯甲烷类5 类共41 种兽药药物残留的高效液相谱-串联质谱分析方法。方法样品经Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液(pH=4)和1%甲酸乙腈提取，无水硫酸钠脱水，C18吸附剂分散固相萃取净化，乙腈饱和的正己烷进一步除脂。采用Zorbax Eclipse Plus C18谱柱，以乙腈和10mmol/L 乙酸铵(含0.1%甲酸) 水溶液为流动相梯度洗脱分离，使用电喷雾离子(ESI)源，在多反应监测(MRM)扫描模式，正负离子扫描方式下进行定性和定量分析。其中2种兽药采用内标法定量，其余39种采用外标法定量。结果 4种三苯甲烷类染料线性范围为0.5～10.0ng/mL ，检出限均为0.2μg/kg ，回收率为76.0%～115.0%；19 种磺胺类化合物、11 种氟喹诺酮类化合物、3种氯霉素类和4 种四环素类化合物线性范围的线性范围为5.00～100.0ng/mL ，19 种磺胺类化合物检出限为0.1～2.0μg/kg ，回收率为64.0%～138.2%，11种氟喹诺酮类化合物检出限为0.1～2.0μg/kg ，回收率为66.1%～128.7%；3种氯霉素类化合物检出限为0.1～0.3μg/kg ，回收率为73.4%～126.7%，4种四环素类化合物检出限为5.0～10.0μg/kg ，回收率为80.1%～124.8%，相对标准偏差(RSD)在0.87%～20.09 %之间。结论该方法操作简便，成本低，环保，可用于水产品中5 类常见兽药药物残留的快速测定。关键词：水产品；兽药多残留；分散固相萃取；液相谱-串联质谱
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20%；而采用1%酸化乙腈和0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液混合提取对于四环素的提取起到了明显的作用，回收率一般达到了50%以上，其他类的回收率均能达到70%以上；因此选定酸化乙腈+Na2
EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液组合进行比例的研究，设定了缓冲溶液与酸化乙腈体积比分别为0.5:10、1:10、2:10、3:10、4:10、5:10六组不同比例提取剂。发现体积比为 2:10时，四环素类化合物的回收率能达到80%以上；其余不同体积比的回收率提升和提取效率无显著差异。
3.1.2 除水剂和净化剂的选择
无水硫酸镁除水剂中的镁离子易与四环素类形成络合物从而影响四环素类的回收率，因此本方法采用无水硫酸钠除水，通过实际测定发现，在本试验条件下加入量为7g 时能充分除去样品中水分。分散固相萃取是将吸附剂直接加入提取液中振摇净化，目前此技术已较多应用于农药残留分析［3-4］，C18能够吸附脂肪等强疏水性干扰物，但是净化往往是个双面的，一方面在净化的同时可能会吸附掉目标化合物，因此需进行验证试验，配制5ml 10μg/L 的标准溶液，分别加入50mg 、100mg 、200mg 、300mg 、400mg 吸附剂，测定各目标物的加标回收率，通过实际测定发现，当C18加入量超过200mg 时，对三苯甲烷类染料有严重的吸附，对其他类没有多大影响。
3.1.3 定容液的选择
本实验中发现定容复溶液对目标化合物的峰形有较大影响，当定容复溶液为纯乙腈时虽充分保证能完全溶解残留在鸡心瓶壁上的目标物，但是由于跟测定时的初始流动相比例性质相差太大，存在明显的类似液相谱分析中产生的溶剂效应，对所有氟喹诺酮类峰形有影响，出峰有开叉现象，对磺胺类3种物质
也有同样的现象，为了改善峰形。经试验发现乙腈-水(6:4)为定容溶液时，各目标物峰形良好。
3.2 仪器条件优化3.2.1 谱柱的选择
选取Zorbax 品牌的poroshell 120 SB-C18、Eclipse Plus C18和SB-C18(均为100mm ×2.1mm ，1.8μm)三种谱柱进样，综合考虑分离度，出峰时间和峰型的对称性，结果发现 Eclipse Plus C18 谱柱分离度最好，且所出目标物峰最对称、灵敏度最高，因此本实验选择Zorbax Eclipse Plus C18谱柱进行实际测定，ESI+、ESI -模式下分析目标物的总离子流图见图1，图2。
3.2.2 流动相的选择
ESI+模式电离条件下，流动相水相中加入0.1％甲酸和乙酸铵，可显著改善和增强酸碱化合物的峰形及保留性，因此正离子模式下本实验有机相设定为乙腈，水相为0.1甲酸+乙酸铵体系，设定了0.1%甲酸+2mmol 乙酸铵，0.1%甲酸+5mmol 乙酸铵，0.1%甲酸+10mmol 乙酸铵三组水相体系进行实际实
Na2EDTA-Mcilvaine 缓冲溶液和10mL 酸化乙腈，涡旋1min ，再加入7g 无水硫酸钠涡旋混匀30s ，超声提取10min ，4000r/min 低温离心5min ，移取上层液至另一洁净50mL 离心管。往残渣中加入10mL 酸化乙腈，重复提取一次，合并两次上层清液。向提取液中加入100mg C18吸附剂，振摇30 s ，4000r/min 低温离心5min ，上清液转移至鸡心瓶中，于40℃旋转蒸干，用2ml 酸化乙腈-水(60+40，V/V)
复溶，充分涡旋溶解管壁上的残留物后转入5ml 塑料离心管中，加入1mL 乙腈饱和正己烷，振摇30s ，置于低温离心机12000r/min 离心5min 。取下层液过0.22μm 有机滤膜后上机。
液相谱-质谱条件(1)正离子模式
谱柱：Zorbax eclipse Plus C18谱柱(2.1×100mm ，1.8μm)；进样量：10μL ；柱温：35℃；流动相：A 相为0.1%甲酸+10mmol/L 乙酸铵水溶液，B 相为乙腈；流速：0.4ml/min 。
电离方式：电喷雾正离子源(ESI+)；检测模式：MRM ；毛细管电压：4.0kV ；干燥气温度：350℃；干燥气流量：11.0L/min ；鞘气(N2)流量：11ml/min ，鞘气(N2)温度：350℃。
(2)负离子模式
谱柱：Zorbax eclipse Plus C18谱柱(2.1×100mm ，1.8μm)；进样量：10μL ；柱温：35℃；流动相：A 相为水，B 相为甲醇；流速： 0.4ml/min 。
电离方式：电喷雾正离子源(ESI-)；检测模式：MRM ；毛细管电压：3.5kV ；干燥气温度：350℃；干燥气流量：11.0L/min ；鞘气(N2)流量：11ml/min ，鞘气(N2)温度：350℃。
3 结果与讨论
3.1 样品前处理的优化3.1.1 提取溶剂的优化
本研究中对象为磺胺类、氟喹诺酮类、氯霉素类 、三苯甲烷类染料和四环素类，根据目前分别已有国家标准和相关文献可知，磺胺类用乙腈水溶液提取，氟喹诺酮类用甲酸乙腈提取，氯霉素类用乙酸乙酯提取，三苯甲烷类染料用乙腈提取，四环素类用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取均有良好的效果。乙腈的提取效果优于甲醇、乙酸乙酯，且乙腈不会提取出较多的基质杂质，同时乙腈有沉降蛋白的作用，故设定乙腈、1%甲酸乙腈和1%甲酸乙腈+0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine (3+7，V/V)缓冲溶液组合等3种提取液进行初筛提取效果的比较，结果表明：采用纯乙腈提取，对于磺胺类、三苯甲烷类染料和氯霉素类效果良好，加标回收率在60%～130%之间，对氟喹诺酮类一般，只有50%～70%之间，对于四环素类没有回收；采用1%甲酸乙腈，对于磺胺类、三苯甲烷类染料、氯霉素和氟喹诺酮类均良好，回收率均在70%～130%之间，对于四环类回收率不到
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种常见渔用兽药，正、负离子模式下分别检测的分析方法。该方法检测成本低、周期短、稳定性好、准确度高。
参考文献：
[1] 岳冬冬，王鲁民.我国水产品产量增长特征研究[J].江苏农业科学， 2012, 40(6): 370-372.
[2]《GB 31650—2019食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》[S]. 北京：农业农村部，2019.
[3］许鹏军，高晓莎，陶晡，等.分散固相萃取-气相谱四极杆质谱联用测定 9 种果品中的螺螨酯残留[J].分析化学，2008，36(11): 1515-1520.
[4] 沈伟健，余可垚，桂茜雯，等.分散固相萃取-气相谱-串联质谱法测定蔬菜中107种农药的残留量[J].谱，2009, 27(40): 391-400.
作者简介：蒙丽琼(1985-)，汉，女，广西灵山人，硕士，工程师，研究方向：食品安全检测。
100种水产美食食谱
基金项目：“十三五”
北海市海洋经济创新示范项目(Bhsfs009)。验，发现当随着乙酸铵浓度的增加，对于磺胺类、氟喹诺酮类和四环素类影响不大，但对于三苯甲烷类有着明显影响，乙酸铵浓度增加，三苯甲烷类出峰时间相对延后，同时相互之间的分离度变好，0.1%甲酸+2mmol 乙酸铵，0.1%甲酸+5mmol 乙酸铵条件下，尽管不断调整优化水相和有机相的梯度冲洗程序，但三苯甲烷类中的隐孔雀石绿和隐结晶紫出峰时间基本重叠，当水相体系为0.1%甲酸+10mmol 乙酸铵时，隐孔雀石绿和隐结晶紫出峰时间分离时间相差在0.3min 以上。
3.3 方法学验证
线性范围、检出限和定量限
取已测定为阴性的对虾样品，加入适量的兽药标准液，进行线性回归、检出限和定量限测试，以信噪比(S/N)≥3、(S/N)≥10确定各组分的检出限和定量限。通过实际测定，在本方法的试验条件下，其灵敏度满足我国水产品药物残留监控的限量要求。
4 结语
本研究利用液相谱-串联质谱，建立了同时提取水产品中磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、氯霉素类和三苯甲烷类共41
图1 ESI+模式基质标准溶液(浓度均为10.0μg/L)的总离子流图
图2 ESI-模式基质标准溶液(浓度均为10.0μg/L)的总离子流图